Методика контрастирования (окраски) парафиновых срезов Гематоксилином и эозином (г.-э)

1) Парафиновые срезы, наклеенные на предметные стёкла, освобождают от парафина (депарафинизируют) поочерёдно погружая их в 2 Порции ксилола (толуола, бензола) – По 3 мин.

2) Производят гидратацию срезов путём поэтапного помещения их в спирты убывающей концентрации (96º, 80º, 60º, 40º, а затем в дистиллированную воду На 3-4 мин .

3) Окрашивают срезы сначала раствором ядерного (основного) красителя - гематоксилина – В течение 2 мин.

4) После этого срезы переносят в водопроводную воду, которая имеет щелочную среду, для окисления гематоксилина. При этом он приобретает синий цвет, а затеи всполаскивают в дистиллированной воде.

5) Окрашивают срезы раствором цитоплазменного (кислого) красителя - Эозина – в течение 0,5-1 мин.

6) Избыток красителя смывают дистиллированной водой в течение 1 мин.

7) Окрашенные срезы обезвоживают. Для этого их помещают в Спирты возрастающей концентрации – поочерёдно в спирты 40º, 60º, 80º, 96º, и 100º – По 1-2 мин.

8) Обезвоженные срезы просветляют в карбол-ксилоле, а затем - в двух порциях ксилола – по 2 мин .

9) Заключение срезов: на срез стеклянной палочкой наносят маленькую каплю раствора канадского бальзама (полистирола, дамар-лака и др.) и накрывают обезжиренным покровным стеклом, осторожно опуская его под углом, стремясь избежать попадания пузырьков воздуха. Сверху можно поместить небольшой грузик для удаления избытка бальзама (полистирола).

Оценка результатов окрашивания

Гематоксилин является щелочным (основным) красителем. Он окрашивает структуры клеток и тканей, имеющие кислую среду, например, ДНК и РНК в ядрах клеток, кислые гликозаминогликаны в межклеточном веществе соединительной ткани. Поэтому такие структуры называются Базофильными (от лат. Basis – основание). В окрашенном гематоксилином микропрепарате ядра клеток будут тёмно-синими или тёмно-фиолетовыми.

Эозин (от греч. заря) имеет красный или розовый цвет и является кислым красителем. Поэтому окрашивающиеся им щелочные компоненты клеток или неклеточных структур называются Оксифильными, Или ацидофильными (от греч. Oxy Или лат. Acidum – кислота), Или эозинофильными .

Следует учесть, что цитоплазма разных клеток может окрашиваться как базофильно, так и эозинофильно. Например, клетки, активно синтезирующие белковые компоненты, содержат в цитоплазме большое количество рибосом (а, следовательно, и РНК), поэтому их цитоплазма окрашивается Базофильно . Если структуры цитоплазмы окрашиваются одновременно и основными, и кислыми красителями, то они называются Нейтрофильными , или Гетерофильными .

Есть целый ряд красителей, например тиазинового ряда (азур, толуидиновый синий, метиленовый синий и др.), которые при взаимодействии с компонентами клеток и тканей изменяют свой цвет на им несвойственный (синий на красный или фиолетовый; чёрный на жёлтый или зелёный и т. д.). Такое явление получило название Метахромазия.

При соблюдении правил приготовления микропрепаратов и применении стойких красителей постоянные микропрепараты Могут сохраняться десятилетиями, не утрачивая своих первоначальных качеств.

Следует помнить , что ядерные и цитоплазменные красители обычно связываются с окрашиваемыми структурами в количествах, пропорциональных содержанию в них реагирующих компонентов. На этом основана Количественная цито - И гистохимия.

1. Депарафинировать в ксилоле - 2 мин.

2. Удалить ксилол 96° спиртом - 2 мин. Затем стекло со срезами поместить в дистиллированную воду - 2 мин (можно дольше).

3. Окрашивание: на срез нанести каплю раствора гематоксилина на 2-З мин.

4. Срез поместить в водопроводную воду на 5- 10 мин (можно на сутки, тогда гематоксилин лучше "вызреет" и окраска будет лучше).

5. Срез ополоснуть дистиллированной водой и нанести каплю раствора эозина - 1 мин.

6. Сполоснуть в 2-3 порциях дистиллированной воды по 0,5-1 мин в каждой.

7. Обезводить в двух порциях 96° спирта по 1 мин в каждом (лучше капать из капельницы).

8. Окончательно обезводить в 100° спирте или карбол-ксилоле – 1 мин.

9. Просветлить срез ксилолом - 2 мин.

10.Заключить срез в бальзам и покрыть покровным стеклом.

После этого препарат подсушивают, чтобы бальзам затвердел. Хранят препараты в защищенном от света месте.

Методика окрашивания гематоксилином
и эозином целлоидиновых срезов

1. Окрасить в гематоксилине в течение 2-3 мин.

2. Промыть сначала в водопроводной, а затем в дистиллированной воде по 2-5 мин.

3. Окрасить в эозине в течение 1-2 мин.

4. Промыть в дистиллированной воде в течение 0,5-1 мин.

5. Обезводить в спиртах восходящей концентрации (70 %, 96 %, 100 %) по 1-2 мин.

6. Просветлить в карбол-ксилоле и ксилоле по 2-3 мин.

7. Заключить окрашенные срезы в бальзам.

Окрашивание срезов для обзорных целей

Различают методы окраски для обзорных целей, применяемые для получения общего представления о морфологии ткани или органа, и специальные, предназначенные для выявления определенных элементов клетки или ткани (например, комплекса Гольджи, митохондрий, эластических волокон соединительной ткани и т.д.). Ниже рассматриваются лишь некоторые методы окрашивания для обзорных целей. Суть их обычно заключается в том, что при этом окрашиваются ядра и каким-то контрастным красителем – цитоплазма.

Ядерные (основные) красители. Для окрашивания ядер используются гематоксилин, кармин, сафранин и другие основные красители. Существует несколько способов приготовления растворов гематоксилина. Наиболее распространенным является гематоксилин Эрлиха.

Гематоксилин Эрлиха. Для его приготовления 2,0 г гематоксилина растворяют в 100 мл 96% спирта и к полученному раствору добавляют 100 мл дистиллированной воды, 100 мл глицерина, 3,0 г калийных квасцов и 10 мл ледяной уксусной кислоты. Все ингредиенты нужно добавлять в указанной последовательности. Полученный раствор необходимо поставить на свету и при доступе воздуха не менее чем на 15 дней с тем, чтобы гематоксилин успел окислиться в гематеин, который и является красящим веществом. Банку с раствором при этом накрывают бумажным колпачком или сложенной в несколько раз марлей. Гематоксилин Эрлиха окрашивает ядра в синий цвет. Его используют при окрашивании срезов гематоксилин-эозином (см. ниже).

Железный гематоксилин Гейденгайна окрашивает в черный цвет не только ядра, но и митохондрии, темные диски скелетной и сердечной мышечной ткани и другие структуры. Для его приготовления 1 г гематоксилина растворяют в 10 мл 96% спирта, добавляют 90 мл дистиллированной воды и оставляют созревать на срок не менее 4 недель. Перед окрашиванием срезы протравливают в течение 2-12 ч в 2,5% растворе железоаммиачных квасцов. Раствор квасцов получают за счет 4-кратного разведения исходного 10% раствора, для приготовления которого используются кри­сталлы квасцов только фиолетового цвета. После промывания в дистиллированной воде срезы окрашивают в течение 1-36 ч раство­ром гематоксилина, разведенным вдвое по сравнению с исходным. В зависимости от исследуемого материала можно использовать и большие разведения красителя. Окрашенный срез ополаскивают дистиллированной водой и дифференцируют под контролем микроскопа в растворе железоаммиачных квасцов. После этого срезы промывают в водопроводной воде не менее 30 мин при частой смене воды.

Железный гематоксилин Вейгерта готовят в виде двух основных растворов - раствора Вейгерта I и раствора Вейгерта II. Раствор Вейгерта I представляет собой 1% раствор

гематоксилина в 90% спирте (1 г гематоксилина на 100 мл спирта). Раствор Вейгерта II имеет следующий состав: официнальный раствор полуторахлористого железа 4 мл, 1 мл концентрированной хлористоводородной кислоты (плотность 1,15-1,19) и 95 мл дистиллированной воды. Официнальный раствор полуторахлористого железа – это 50% раствор водного хлорного железа (FеСl 3 , 6Н 2 0). Перед употреблением смешивают равные объемы основных растворов. Основные растворы хранятся 3-4 мес. Смешанный раствор можно применять лишь несколько дней. Время окрашивания 1-5 мин. Затем следует промывка водопроводной водой. Срезы можно дифференцировать 0,1% раствором хлористоводородной кислоты в 70% спирте, после чего их тщательно промывают водопроводной водой. Железный гематоксилин Вейгерта должен окрашивать ядра в черный цвет. Если они приобретают коричневый цвет, то это свидетельствует о порче красителя.

Квасцовый карминприготовляют, растворяя 3-5 г аммиачных квасцов в 100 мл дистиллированной воды при нагревании, и добавляют 1 г кармина. Раствор кипятят 15 мин, охлаждают, фильтруют и добавляют 1 мл формалина. Время окрашивания – 0,5-24 ч, дифференцировка в дистиллированной воде проводится до прекращения отдачи красителя. Ядра окрашиваются в ярко-красный цвет. Окраску кармином можно проводить после импрегнации серебром или при выявлении железа.

Сафранин является прекрасным ядерным красителем, осо­бенно для материала, фиксированного в растворах, содержащих осмий или хром. 10 г чистого сафранина или сафранина «С-ехtrа» (качество красителя имеет очень большое значение) растворяют в смеси 155 мл 96% спирта со 145 мл дистиллированной воды. Из полученного таким образом основного раствора перед употреблением берут 20 мл и добавляют 80 мл 50% спирта. Время окрашивания 24 ч. После ополаскивания в дистиллированной воде срезы дифференцируют, контролируя под микроскопом в 0,1% растворе хлористоводородной кислоты в абсолютном спирте. Затем следует промывка абсолютным спиртом, просветление в ксилоле, заключение в бальзам.

Кислые красители. Эти красители не являются избирательно цитоплазматическими. Красители для цитоплазмы подбирают таким образом, чтобы их цвет хорошо контрастировал с окраской ядер. Для докрашивания цитоплазмы после окраски ядер гематоксилином чаще всего используется 1% водный раствор эозина. Для срезов, окрашенных кармином, используют раствор пикриновой кислоты, полученный путем разведения водой насыщенного раствора пикриновой кислоты в отношении 1:3 (при комнатной температуре в 100 мл воды растворяется примерно 1,2 г пикриновой кислоты, следовательно, для получения насыщенного раствора следует взять чуть больше этого количества пикриновой кислоты). Время окра­шивания 2-5 мин. Цитоплазма клеток и эритроциты красятся в желтый цвет.

Методика окрашивания срезов гематокси­лин-эозином. Эта методика наиболее часто применяется и поэтому должна быть описана более детально. Этим методом можно окрашивать целлоидиновые срезы, депарафинированные, парафиновые или замороженные срезы. Замороженные срезы перед окрашиванием следует обезжирить, поместив их на 20-30 мин или на ночь в 96% спирт. Далее срезы переносят в дистиллиро­ванную воду. Целлоидиновые срезы переносят из одного бюкса в другой с помощью препаровальной иглы с загнутым концом. Депа­рафинированные и замороженные срезы можно окрашивать на предметном стекле, наливая или сливая соответствующие растворы. Растворы красителей при этом можно сливать обратно для повтор­ного использования.

Порядок окрашивания срезов гематоксилин-эозином следу­ющий: 1) срезы переносят в дистиллированную воду;

2) окрашивают гематоксилином Эрлиха 2-5 мин;

3) промывают в дистиллирован­ной воде;

4) затем промывают в водопроводной воде 3-5 мин;

5) осуществляют контроль под микроскопом;

6) дифференцируют 1% раствором хлористоводородной кислоты в 70° спирте 1-2 с;

7) быстро переносят срезы в водопроводную воду на 30 мин при частой смене; в водопроводной воде вишневая окраска ядер сменяется синей;

8) осуществляют контроль под микроскопом; если хроматин и ядрышко видны недостаточно четко, то дифференцировку следует повторить (срезы можно смотреть под большим увеличением, накрыв их покровным стеклом);

9) промывают в дистиллированной воде;

10) 1% водный раствор эозина 0,5-1 мин;

11) промывают в дистиллированной воде (и дифференцируют, так как вода смывает эозин); время промывки контролируют по цвету среза;

12) проводят обезвоживание, осветляют в ксилоле, заключают в бальзам. В спир­тах эозин также отмывается, так что проводить срезы по спиртам следует быстро. Время окрашивания в гематоксилине нужно устано­вить на первых 2-3 срезах и затем все срезы данного блока окраши­вать одинаково. Дифференцировку в растворе хлористоводородной кислоты в спирте можно не проводить, но в этом случае структуры ядра будут менее четкими, и в цитоплазме может быть синеватый фон.

Методика окрашивания азур-2-эозином. Эта методика также вполне пригодна для обзорных целей. Прогрессив­ный метод окрашивания азур-2-эозином довольно ненадежен, но регрессивный дает стабильные результаты. Основными растворами являются 0,1% водный раствор азура и 0,1% водный раствор эозина. Для приготовления рабочего раствора на 100 мл дистиллированной воды добавляют 100 капель основного раствора азура и 100-120 капель раствора эозина. Срезы помещают в раствор красителя на 12-24 ч. Затем срезы дифференцируют. Методы дифференцировки могут быть разными в зависимости от того, насколько интен­сивно окрасились срезы. Дифференцировку можно проводить в подкисленной дистиллированной воде, затем промывать в чистой дистиллированной воде, обезвоживать в спиртах, просветлять в кси­лоле и заключать в бальзам. При этом следует учесть, что в спиртах дифференцировка продолжается. Можно дифференцировать срезы прямо в 96% спирте. Ход дифференцировки контролируют под микроскопом. Окрасив несколько срезов, можно контролировать на глаз по цвету среза, время от времени выборочно проверяя качество окраски под микроскопом.

Методика окрашивания железным гематоксилин-пикрофуксином по Ван-Гизону. Срез окра­шивают железным гематоксилином Вейгерта в течение 2-5 мин. Вместо гематоксилина Вейгерта можно использовать гематоксилин Эрлиха. Дифференцировки не требуется, так как срезы дифферен­цируются в пикрофуксине. Для приготовления раствора пикрофуксина к 100 мл насыщенного водного раствора пикриновой кислоты добавляют 10 мл 1% водного раствора кислого фуксина. Раствор пикрофуксина хранится длительное время. После окрашивания железным гематоксилином срезы ополаскивают в дистиллирован­ной воде и переносят в пикрофуксин на 3-5 мин. Затем промывают дистиллированной водой, обезвоживают в спиртах, начиная с 96%, проводят через ксилол и заключают в бальзам. В воде смывают фуксин. Если пропустить промывку в воде – обсушить срез филь­тровальной бумагой, что иногда делают, мышечная ткань может быть окрашена в розовый цвет, а не в желтый, как полагается. Если промывать в воде слишком долго, фуксин смывается полностью. Пикриновая кислота смывается в спирте, поэтому обезвоживать нужно быстро. В результате окрашивания ядра клеток должны быть темно-коричневыми (или темно-фиолетовыми при окрашива­нии гематоксилином Эрлиха), коллагеновые волокна – красными, мышечная ткань, цитоплазма различных клеток и эритроциты – желтыми.

Вопросы для самопроверки

1. Определение гистологии как науки.
2. Объекты исследования гистологии.
3. Перечислите основные свойства микроскопического препарата.
4. Назовите основные этапы изготовления гистологического препарата.
5. Какие группы красителей используют в гистологической практике?
6. Чем отличаются временные гистологические препараты от постоянных?
7. Объясните принцип работы на микротоме?
8. Техника приготовления тотальных препаратов.
9. Какие методы исследования применяют в цитологии и гистологии?
10. Типы микроскопов.
11. Сходства и различия в световой и электронной микроскопии? Разрешающая способность и увеличение.
12. Правила пользования и устройство светового биологического микроскопа.
13. Правила оформления лабораторной работы.
14. Техника приготовления гистологического препарата – окраска гематоксилин и эозином.
15. Дайте характеристику и классификацию фиксаторам.
16. Назовите наиболее употребительные фиксаторы.
17. Назовите оптимальную толщину срезов при использовании заливки в парафин.
18. Преимущества и недостатки четырёх способов уплотнения материала: заливка в парафин, заливка в целлоидин, заливка в желатину; замораживание.
19. Для каких исследований применяют заливку в поливакс (карбовакс). Сущность этого метода.
20. Различные методы окраски гистологических срезов.
21. Методы окрашивания для обзорных целей.

Примерная схема окраски препаратов гематоксилин - эозином

1. Парафиновые или замороженные срезы доводят до воды.

2. Окраска гематоксилином - в течении 3-5 минут.

3. Промывка в воде - 2 минуты.

4. Дифференцировка в спирте, подкисленном соляной кислотой (1% раствор соляной кислоты в 70% спирте), несколько секунд с последующим восстановлением подщелоченной водой (около 1 минуты). Этот этап желателен, но не обязателен.

5. Промывка в проточной воде.

6. Ополаскивание дистиллированной водой.

7. Окраска 1% эозином - 1-2 минуты.

8. Ополаскивание дистиллированной водой.

9. Обезвоживание в спирте - 2 мин.

10. Просветление в ксилоле - 2 мин

11. Заключение среза - капля бальзама, покровное стекло.

Методы исследования в гистологии и цитологии

Методы исследования в гистологии включают приготовление гистологических препаратов и их изучение с помощью микроскопа.

Основным методом гистологического исследования является световая микроскопия, разновидностями которой являются:

- фазово-контрастная микроскопия - основана на смещении фаз световых волн при прохождении лучей через разные по плотности структуры изучаемого объекта, что приводит к повышению контрастности этих структур и позволяет рассматривать неокрашенные и живые клетки;

- интерференционная микроскопия - основана на разном ходе световых лучей, дающих такое изображение объекта, по которому можно судить о концентрации различных веществ в клетке;

- поляризационная микроскопия - основана на двойном лучепреломлении клеточных структур, что позволяет изучать спиральные или не видимые при других методах исследования структуры (например, миофибриллы);

- люминесцентная (флуоресцентная) микроскопия - основана на явлении свечения некоторых веществ при действии на них коротковолновых лучей, что даёт возможность исследовать содержание в клетках нуклеиновых кислот, некоторых белков, при этом препараты предварительно окрашивают специальными красителями - флюорохромами;

- ультрафиолетовая микроскопия - основана на использовании ультрафиолетовой части спектра для просвечивания объекта.

Для изучения тонкого внутреннего строения клеток и межклеточных структур (ультраструктур) используют электронную микроскопию.

Для выявления в клетках различных химических соединений (аминокислот, белков, жиров, углеводов, минеральных веществ и т.д.) используют гистохимические методы исследования, основанные на использовании красителей, которые избирательно связываются только с теми химическими соединениями клетки, которые необходимо изучить, и окрашивают их, делая видимыми.

Метод радиоавтографии, основанный на введении в клетку изотопов, которые включаются в соответствующие структуры (например, меченый тимидин встраивается в ядра клеток, синтезирующих ДНК), используется для изучения течения синтетических процессов в тканях.

Для изучения механизмов пролиферации и дифференцировки клеток, их реакции на различные воздействия используют метод культуры клеток и тканей, который основан на выращивании вне организма в искусственных питательных средах различных клеток.

Одним из современных методов, используемых в гистологии, является конфокальная микроскопия, которая позволяет получать трёхмерное изображение исследуемого объекта с помощью специальных компьютерных программ.

библиографическое описание:
Замечания по технике окрашивания — .

код для вставки на форум:
Замечания по технике окрашивания — .

wiki:
— .

При окраске водными красителями срезы переносят в краситель из дистиллированной воды, а при окраске спиртовыми - из соответствующего раствора спирта. После того как препарат приобретает интенсивную окраску, его промывают в воде или спирте для удаления избытка красителя (дифференцировка), контролируя этот процесс под микроскопом.

Срезы тканей после целлоидиновой и парафиновой заливки, а также полученные на замораживающем микротоме окрашивают в широкогорлых бюксах или на часовых стеклах. Одновременно окрашивают несколько срезов, промывают, дифференцируют и т.д. каждый срез отдельно.

Препараты можно помещать в красящий раствор в специальных контейнерах, предназначенных для одновременного окрашивания большого количества стекол. Если препаратов немного, то рациональнее краситель наносить непосредственно на срез по каплям с помощью пипетки. Остатки красителя можно слить в склянку и использовать повторно. Д. Кисели (1962) предлагал накрывать при этом срезы стеклянным колпаком, а для увлажнения среды оставлять под колпаком смоченную водой вату.

1. ЯДЕРНЫЕ КРАСИТЕЛИ И ИХ ПРИГОТОВЛЕНИЕ

Окрашивание ядер клеток обусловлено двумя механизмами химического взаимодействия: 1) основные красители, например анилиновые, образуют соли в присутствии ДНК и РНК; 2) образуются комплексы с ионами металлов при применении протравы. В практической работе чаще используют протравные красители. К ним относятся гематоксилин, кармин, сафранин, галлоцианин, ализарин. Хорошо окрашивают ядра такие красители, как янус зеленый, основной коричневый, оксазиновые красители (крезиловый фиолетовый, нильский голубой), тионин, азуры, метиленовый синий, основной фуксин, метиловый зеленый и др. Следует упомянуть о хороших результатах окраски ядер соком черники, которая предложена М.Д. Лавдовским еще в 1887 г.

Гематоксилин и способы его приготовления

Гематоксилин имеет растительное происхождение: его получают из эфирного экстракта кампешевого дерева. Гематоксилин хорошо растворяется в спирте и плохо в воде. Красящими свойствами обладает продукт окисления гематоксилина - гематеин, поэтому краситель становится пригодным только после созрева­ния - окисления, на которое требуется от 10 дней до 2-3 нед. Созревание можно ускорить с помощью солей алюминия, хрома, железа и др.

Гематоксилин Эрлиха

1. Гематоксилин кристаллический 2г

2. Спирт 96% 100мл

3. Дистиллированная вода 100 мл

4. Глицерин 100 мл

5. Алюмокалиевые или алюмоаммонийные квасцы 3г

6. Ледяная уксусная кислота 10 мл

Гематоксилин растворяют в спирте, а квасцы - в дистиллированной воде, смешивают оба раствора и затем добавляют остальные компоненты. Раствор периодически перемешивают. Через 10-14 дней он приобретает темно-вишневый цвет, что свидетельствует о готовности красителя. Продолжительность окрашивания гематоксилином Эрлиха 4-6 мин. Затем следуют промывание в дистиллированной, потом в водопроводной воде, дифференцировка в 1 % солянокислом спирте, восстановление в аммиачной воде и окончательное промывание в дистиллированной воде. Для приготовления солянокислого спирта к 100мл-70% спирта добавляют 1мл концентрированной соляной кислоты. Для приготовления аммиачной воды к 50мл дистиллированной воды добавляют 2 капли крепкого аммиака.

Результат: ядра клеток тёмно-синие(оболочка, хроматин), ядерный матрикс бледно-голубой или прозрачный.

Гематоксилин Делафильда

1. Гематоксилин кристаллический 4гр

2. Спирт 96% 25мл

3. Алюмокалиевые или алюмоаммониевые квасцы 40гр

4. Дистиллированная вода 400мл

Приготовление: спирт+гематоксилин+квасцы=3-4дня на свету, перемешывая,фильтруют+100мл глицерина+100мл метилового спирта=3-4 дня на свету, фильтруют. Перед применением разбавляют в 2 раза дистиллированной водой или 2% раствором алюмокалиевых квасцов.Окрашывание 4-6 минут, промывание в дистиллированной воде, дифференцировка в солянокислом спирте, восстановление в амиачной воде, промывание в ДВ.В результате хроматин и кариолемма ярко-синие.

Гематоксилин Гарриса

1. Кристалическый гематоксилин 5 гр + спирт 50мл-96%

2. Алюмоамонийные квасцы 100гр+ ДВ 1литр

3. Смешывают + 60мл глицерина + 2,5 оксида ртути. Нагревают до 100С, остужают, фильтруют. Перед использованием до 100мл раствора добавляют 2 мл ледяной уксусной кислоты. Окраска 3-4 минуты, дает чёткие ярко-синие ядра.

Гематоксилин Гарриса в модификации Кисели

Исключил квасцы.

1. Кристалическый гематоксилин 1 гр + спирт 10мл-96%

2. Кристалический гематоксилин 20гр + ДВ 200мл

3. Смешивают, доводят до кипения, + 500мг желтого оксида ртути. Остужают, фильтруют, готов к использованию. Окраска 4-6 минут, дает ярко-синие ядра.

Гематоксилин Ганзена

4. Кристалическый гематоксилин 1 гр + спирт 10мл-100%

5. Алюмокалиевые квасцы 20гр+ ДВ 100мл

6. Смешывают + 3мл насыщеного раствора перманганата калия. Нагревают до 100С, остужают, фильтруют. Окраска 3-4 минуты, дает красно-фиолетовые ядра.

Гематоксилин Маллори(водный)

Кристалическый гематоксилин 2,5 гр + алюмоамонийные квасцы 50гр+ ДВ 1литр

Выдержывают 10 суток при 25С, +440мг перманганата калия и 2,5гр тимола, перемешивают,

фильтруют. Синие ядра.

Кислый гемалаун Майера(водный)

1. Кристалический гематоксилин 1 гр

2. Алюмоамонийные квасцы 50гр

3. ДВ 1литр

4. Йодат натрия 200мг

5. Хлоралгидрат 50гр

6. Лимонная кислота 1 гр

Квасцы растворяют в воде без нагревания, затем добавляют и растворяют гематоксилин, йодат натрия, лимонную кислоту и последним - хлоралгидрат. После растворения всех компонентов краску фильтруют, и она готова к применению.

Продолжительность окрашивания 4-6 мин.

Результат: ядра красно-фиолетовые.

Гематоксилин Кораци (водный)

1. Гематоксилин кристаллический 0,1 г

2. Йодат калия 2-3 кристал

3. Алюмокалиевые квасцы 5 г

4. Дистиллированная вода (теплая) 100 мл

Смесь перемешивают до полного растворения и добавляют 25 мл глицерина. Раствор перед использованием фильтруют. Продолжительность окрашивания 1-2 мин. Результат: ядра ярко-синие.

Железный гематоксилин Гейденгайна

1. Гематоксилин кристаллический 1 г

2. Спирт 96 % 10мл

3. Дистиллированная вода 90 мл

Краситель созревает 4 нед. Добавление 100 мг йодата натрия ускоряет «созревание» - он готов к использованию уже через 1 ч после приготовления. Окрашивание проводят разведенным в 2 раза раствором.

Продолжительность окрашивания 1 -36 ч.

Методика окрашивания

1. Препарат помещают в 2,5 % раствор железоаммонийных квасцов на 2-12 ч.

2. Ополаскивают в дистиллированной воде.

3. Окрашивают гематоксилином Гейденгайна 1-36 ч.

4. Промывают в водопроводной воде - 3 смены по 10 мин, затем обезвоживают, просветляют, заключают.

Результат: ядра и цитоплазматические структуры черные и синевато-черные.

Железный гематоксилин Брусси

1. Гематоксилин кристаллический 1 г I

2. Дистиллированная вода при 40 "С 100 мл I

3. Железоаммонийные квасцы 8 г II

4. Дистиллированная вода при 40 "С 100 мл II

Растворы I и II смешивают, фильтруют. Продолжительность окрашивания 30 с-1 мин. Затем промывают в водопроводной воде, обезвоживают, просветляют заключают.

Результат: ядра синевато-черные.

Железный гематоксилин Вейгерта

1. Гематоксилин кристаллический 1 г А

2. Спирт 96 % 100мл А

3. Раствор трихлорида железа гексагидрата 50%-4 мл В

4. Дистиллированная вода 95 мл В

5. Концентрированная соляная кислота 1 мл В

Растворы хранят в отдельных склянках с притертыми пробками. Перед использованием нужное для окрашивания количество краски получают путем смешивания растворов А и Б в пропорции 1:1.

Продолжительность окрашивания 1-2 мин, затем промывают в водопроводной воде.

Результат: ядра черно-синие.

Другие ядерные красители

Кармин

• Кармин 1 г
• Дистиллированная вода 100 мл
• Раствор кипятят 15 мин,охлаждают, фильтруют, добавлявляют
• 10 мл 40 % формалина.

Продолжительность окрашивания 30 мин-24 ч. Затем следует промывание в дистиллированной воде, дифференцировать в солянокислом спирте, обезвоживание, просветление и заключение.

Результат: ядра ярко-красные.

Сафранин

Обеспечивает получение хороших результатов после фиксации ткани в тетраоксиде осмия и особенно после применении фиксаторов, содержащих хром.

• Основной раствор:Сафранин-10г + Спирт 96-155мл + Дистилл вода-145мл
• Краситель: -Основной р-р 20мл + Спирт 50%-80мл

Продолжительность окрашивания 24 ч. Затем следуют промывание дистиллированной водой, дифференцировка в солянокислом спирте, дистиллированная вода, обезвоживание, просветление и заключение.

Результат: хроматин ядер и кариолемма ярко-красные.

Галлоцианин

• Галлоцианин 100 г
• Хромовые квасцы 5 г
• Дистиллированная вода 100 мл

Сначала растворяют квасцы, затем добавляют Галлоцианин, раствор кипятят при постоянном помешивании, охлаждают, фильтруют. Срок годности красителя 1 мес.

Продолжительность окрашивания 24-48 ч. Затем следуют промывание в 2 сменах дистиллированной воды, обезвоживание, просветление и заключение.

Результат: хроматин и тигроидное вещество синевато-черные.

Сок черники

Свежие чистые ягоды черники разминают в фарфоровой ступке, смешивают с равным объемом 96 % спирта, настаивают 1- 2 сут и фильтруют. Перед окрашиванием часть раствора разводят равным количеством 2 % водного раствора алюмокалиевых квасцов и добавляют 2-3 кристаллика тимола.

Продолжительность окрашивания 5-7 мин. Затем следуют промывание в дистиллированной воде, дифференцировка в солянокислом спирте, промывание в дистиллированной воде, обезвоживание, просветление и заключение.

Результат: ядра темно-фиолетовые.

2. ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКИЕ КРАСИТЕЛИ

Окрашивание цитоплазмы клеток происходит в результате связывания оснований и белков кислотными красителями. В группу диффузных (кислых) красителей входят карбоновые и сульфоновые кислоты, нитро-, азокрасители и др. В гистологической практике постоянно применяют эозины, пикриновую кислоту, оранжевый Г, кислый фуксин, конго красный (конгорот), азокармин, эритрозин. Чаще используют 1 % водные растворы этих красителей, но можно применять и 1 % спиртовой раствор.

Продолжительность окрашивания колеблется от 5 с до 3-5 мин в зависимости от сорта и серии красителя. Если препарат перекрашивается, то излишек краски легко удаляется при ополаскивании в дистиллированной воде и последующем обезвоживании препарата или среза в спиртах.

Смесь кислого фуксина и пикриновой кислоты (пикрофуксин) готовят из насыщенного водного раствора пикриновой кислоты и 1 % водного раствора кислого фуксина (см. главу 22).

3. Методика окраски гематоксилином и эозином

Процедура окрашивания срезов, полученных на замораживающем микротоме, после парафиновой или целлоидиновой заливки различается лишь по техническим приемам, а порядок проведения окраски одинаков.

1. Раствор гематоксилина 1-20 мин
2. Дистиллированная вода ополоснуть
3. Солянокислый спирт дифференцировка
4. Аммиачная вода срезы синеют (контроль под микроскопом)
5. Проточная вода 5-10 мин
6. Дистиллированная вода ополоснуть
7. Раствор эозина 10 с-3 мин
8. Спирт 96 %,
9. карбол-ксилол, заключение.

Результат: ядра синие, цитоплазмаи межклеточное веществорозовые.

Эта окраска является двойной: гематоксилин - основной краситель - окрашивает ядра клеток, эозин - кислый краситель - красит протоплазму клеток и в меньшей степени - различные неклеточные структуры.

Окраска включает использование основного красителя гематоксилина , окрашивающего базофильные клеточные структуры ярко-синим цветом, и спиртового кислого красителяэозина Y , окрашивающего эозинофильные структуры клетки красно-розовым цветом. Базофильные структуры, как правило, это те, которые содержатнуклеиновые кислоты (ДНК иРНК ):клеточное ядро ,рибосомы и РНК-богатые участкицитоплазмы . Эозинофильные структуры содержат внутри- и внеклеточныебелки , например,тельца Леви . Цитоплазма является эозинофильной средой.Эритроциты всегда прокрашиваются ярко-красным цветом.

2. Окраска железным гематоксилином

Краситель для микроскопических препаратов. Обеспечивает визуализацию ядер клеток в срезах (парафиновых, криостатных, вибрoтомных, изготовленных на заморажи-вающем микротоме) и цитологических препаратах. Реагент не содержит этанола и метанола. Предназначен для использования в качестве ядерного красителя при окраске соединительной ткани по Ван-Гизону, Маллори, Массону и в других многоцветных методах окраски гистологических препаратов. Достоинствами предлагаемого гематоксилина являются отличное и интенсивное окрашивание ядер клеток в срезах, устойчивость окраски к пикриновой Кислоте и другим слабым кислотам, отсутствие тенденции к перекраске препарата(при соблюдении рекомендаций) и необходимости дифференцировки окраски.

3. Окраска метиленовым синим Лефлера Методика окраски. Смешивают 30 мл насыщенного спиртового раствора метиленового синего со 100 мл 0,01 % раствора гидроксида калия. Мазки окрашивают в течение 3 - 5 мин, ополаскивают в проточной воде, дифференцируют 3 сек в 0,5 % растворе уксусной кислоты и ополаскивают в проточной воде. Проводят через спирты, просветляют в ксилоле и заключают в бальзам. Препараты можно изучать при масляной иммерсии без заключения в бальзам, но в этом случае они хранятся недолго. Результат: бактерии окрашиваются в густо-синий цвет.

Органический основной тиазиновый краситель , применяют для окраскихлопка ,шерсти ,шелка в ярко-голубой цвет, однако окраска слабоустойчива на свету. Ваналитической химии применяется для определенияхлоратов ,перхлоратов ,катионов ртути ,олова ,магния ,кальция ,кобальта ,кадмия .

В медицине используется в качествеантисептика ,антидот при отравлениицианидами ,угарным газом исероводородом . Имеются сообщения о высокой эффективности этого соединения при леченииболезни Альцгеймера .

4. Окраска пикрофуксином

При окраске пикрофуксином набухшие коллагеновые пучки ярко-красного цвета, гомогенные с плохо различимым волокнистым строением. В очагах более резкого поражения коллагеновые пучки неравномерной окраски, местами они ярко-красные, местами с пятнами желтого цвета, местами коричневые. 5. Окраска по Романовскому-Гимзе Приготовление красителя Готовый жидкий краситель перед окрашиванием мазков разводят из расчета 1-2 капли красителя на 1 мл дистиллированной воды. Мазки окрашивают 20 - 25 минут при 370 C во влажной камере (закрытая чашка Петри с увлажнённым фильтром на дне). После окрашивания мазки промывают в проточной воде, сушат на воздухе и исследуют при масляной иммерсии. Красящую смесь Романовского-Гимзы в виде порошка (коммерческий краситель) растворяют в смеси равных объемов метилового спирта и глицерина (800 мг красителя на 100 мл растворителя). Краситель растворяется плохо, поэтому лучше его растереть с растворителем в количестве 300 мг на 100 мл, а затем, помешивая, добавлять краситель до получения нужной концентрации. Приготовление красителя часто занимает несколько дней. Важно в качестве растворителей использовать химически чистый метиловый спирт и глицерин, так как примеси ухудшают свойства красителя. Вместо метилового спирта можно применять 100 % этиловый спирт. Приготовленную красящую смесь хранят в сухом прохладном месте в плотно закрытом сосуде. Методика окраски 1. Мазки, фиксированные в метиловом спирте, окрашивают раствором (1 мл готовой жидкой краски + 2 мл основного буферного раствора + 47 мл дистиллированной воды) в течение 40-120 мин (продолжительность окрашивания подбирают эмпирически). Пользуются фосфатным буфером, но рН буфера зависит от вида мазка: для мазка костного мозга - 5,8 - 6,0, для мазка крови - 6,4 - 6,5, для выявления простейших - 6,8, малярийного плазмодия - 7,0 - 7,2. 2. Ополаскивают в дистиллированной воде, высушивают и исследуют при иммерсии. Результат: бактерии окрашиваются в фиолетово-красный цвет, цитоплазма клеток - в голубой, ядра - в красный.

6. Окрашивание конго-красным

Внешний вид - красно-коричневые кристаллы. плохо растворим в холодной воде. В органических растворителях не растворяется.Данный краситель находит применение в микроскопических исследованиях и используется, в виде спиртового, водного или аммиачного раствора для окрашивания клеточной оболочкигрибов (самостоятельно, либо в сочетании сгенциановым фиолетовым ) . Конго красный широко применяется в гистологии для выявления амилоида . Помимо этого "классического" применения, конго красный используется в десятках других процедур окрашивания в зоологии беспозвоночных, ботанических исследованиях, цитологии человека и животных .