Ферментативная активность почв. Изменение ферментативной активности почв при нефтяном загрязнении Изменение активности почвенных ферментов под действием
Ферментативная активность почв [от лат. Fermentum - закваска] -способность почвы проявлять каталитическое воздействие на процессы превращения экзогенных и собственных органических и минеральных соединений благодаря имеющимся в ней ферментам. Характеризуя ферментативную активность почв, имеют в виду суммарный показатель активности. Ферментативная активность различных почв неодинакова и связана с их генетическими особенностями и комплексом взаимодействующих экологических факторов. Уровень ферментативной активности почв определяется активностью различных ферментов (инвертазы, протеаз, уреазы, дегидрогеназ, каталазы, фосфатаз), выражаемой количеством разложенного субстрата за единицу времени на 1 г почвы.
Биокаталитическая активность почв зависит от степени обогащенности их микроорганизмами и от типа почв. Активность ферментов изменяется по генетическим горизонтам, которые отличаются по содержанию гумуса, типам реакций, окислительно-восстановительным потенциалом и другими показателями по профилю.
В целинных лесных почвах интенсивность ферментативных реакций в основном определяют горизонты лесной подстилки, а в пахотных - пахотные слои. Все биологически менее активные генетические горизонты, находящиеся под горизонтами А или Ап, имеют низкую активность ферментов. Активность их незначительно возрастает при окультуривании почв. После освоения лесных почв под пашню ферментативная активность образованного пахотного горизонта по сравнению с лесной подстилкой резко снижается, но по мере его окультуривания повышается и в сильно окультуренных почвах приближается или превышает показатели лесной подстилки.
Ферментативная активность отражает состояние плодородия почв и внутренние изменения, происходящие при сельскохозяйственном использовании и повышении уровня культуры земледелия. Эти изменения обнаруживаются как при вовлечении целинных и лесных почв в культуру, так и при различных приемах их использования .
По всей Беларуси в пахотных почвах ежегодно теряется до 0,9 т/га гумуса. В результате эрозии ежегодно безвозвратно уносится с полей 0,57 т/га гумуса. Причинами дегумификации почв являются усиление минерализации почвенного органического вещества, отставание процессов новообразования гумуса от минерализации в связи с недостаточным поступлением в почву органических удобрений и снижения ферментативной активности почвы .
Биохимические превращения органического вещества почвы происходят в результате микробиологической деятельности под влиянием ферментов. ферментативный активность почва микроорганизм
Особую роль играют ферменты в жизнедеятельности животных, растений и микроорганизмов. Почвенные ферменты участвуют при распаде растительных, животных и микробных остатков, а также синтезе гумуса. В результате питательные вещества из трудно усвояемых соединений переходят в легко доступные формы для растений и микроорганизмов. Ферменты отличаются высокой активностью, строгой специфичностью действия и большой зависимостью от различных условий внешней среды. Благодаря каталитической функции они обеспечивают быстрое протекание в организме или вне его огромного числа химических реакций .
Совместно с другими критериями ферментативная активность почв может служить надёжным диагностическим показателем для выяснения степени окультуренности почв. В результате исследований 4, с. 91 установлена зависимость между активностью микробиологических и ферментативных процессов и проведением мероприятий, повышающих плодородие почв. Обработка почв, внесение удобрений существенно изменяют экологическую обстановку развития микроорганизмов.
В настоящее время в биологических объектах обнаружено несколько тысяч индивидуальных ферментов, а несколько сотен из них выделено и изучено. Известно, что живая клетка может содержать до 1000 различных ферментов, каждый из которых ускоряет ту или иную химическую реакцию .
Интерес к применению ферментов вызван еще и тем, что постоянно возрастают требования по увеличению безопасности технологических процессов. Присутствуя во всех биологических системах, являясь одновременно продуктами и инструментами этих систем, ферменты синтезируются и функционируют при физиологических условиях (pH, температура, давление, присутствие неорганических ионов), после чего легко выводятся, подвергаясь разрушению до аминокислот. Как продукты, так и отходы большинства процессов, протекающих с участием ферментов, являются нетоксичными и легко разрушаемыми. Кроме того, во многих случаях, ферменты, используемые в промышленности, получают экологически безопасным путем. От небиологических катализаторов ферменты отличают не только безопасность и повышенная способность к биодеградации, но и специфичность действия, мягкие условия протекания реакций и высокая эффективность. Эффективность и специфичность действия ферментов позволяет получать целевые продукты с высоким выходом, что делает использование ферментов в промышленности экономически выгодным. Применение ферментов способствует сокращению расхода воды и энергии в технологических процессах, уменьшает выбросы в атмосферу CO2, снижает риск загрязнения окружающей среды побочными продуктами технологических циклов .
Применением передовой агротехники можно изменять в благоприятную сторону микробиологические процессы не только пахотного, но и подпахотного слоев почвы.
При непосредственном участии внеклеточных ферментов происходит разложение органических соединений почвы. Так, протеолитические ферменты расщепляют белковые вещества и до аминокислот.
Уреаза разлагает мочевину до СО2 и NH3. Образующийся аммиак и аммонийные соли служат источником азотного питания растений и микроорганизмов.
Инвертаза и амилаза участвуют в расщеплении углеводов. Ферменты группы фосфатов разлагают фосфорорганические соединения почвы и играют важную роль в фосфатном режиме последней.
Для характеристики общей ферментативной активности почвы обычно используют наиболее распространенные ферменты, свойственные подавляющему большинству почвенной микрофлоры - инвертазу, каталазу, протеазу и другие .
В условиях нашей республики проводилось немало исследований 16, с. 115 по изучению изменения уровня плодородия и ферментативной активности почв при антропогенном воздействии, однако полученные данные не дают исчерпывающий ответ на характер изменений из-за сложности сопоставления результатов в виду различия условий проведения опытов и методик исследований.
В связи с этим поиск оптимального решения проблемы улучшения гумусного состояния почвы и ее ферментативной активности в конкретных почвенно-климатических условиях на основе разработки ресурсосберегающих приемов основной обработки почвыё применения почвозащитных севооборотов, способствующих сохранению структуры, предотвращению переуплотнения почвы и улучшению их качественного состояния и восстановлению плодородия почв при минимальных затратах, весьма актуален.
Цель работы ‑ определение биологической активности почв на разном удалении от дороги по четырем ферментным системам: дегидрогеназам, каталазе, инвертазе, уреазе.
Основные понятия
Почвенно-энзимологические методы позволяют определять не количественное содержание ферментов в почве, а активность ферментов, находящихся преимущественно в адсорбированном (иммобилизованном) состоянии на поверхности почвенных коллоидов и частично в почвенном растворе.
Принципметода определения активности почвенных ферментов основан на учете количества переработанного в процессе реакции субстрата или образующегося продукта реакции в оптимальных условиях температуры, рН среды и концентрации субстратов.
Ферменты, относящиеся к классу оксидоредуктаз, катализируют окислительно-восстановительные реакции, играющие ведущую роль в биохимических процессах в клетках живых организмов, а также в почве. Наиболее распространены в почвах такие оксидо-редуктазы, как каталаза и дегидрогеназы, активность которых является важным показателем генезиса почв.
Каталазаразлагает на воду и молекулярный кислород ядовитую для клетки перекись водорода, образующуюся в процессе дыхания живых организмов в результате различных биохимических реакций окисления органических веществ.
Активность каталазы определяется газометрическим методом по объему выделившегося кислорода, основанным на измерении скорости разложения перекиси водорода при ее взаимодействии с почвой.
Дегидрогеназы ‑ ферменты, которые участвуют в процессе дыхания, отщепляя водород от окисляемых субстратов. Одни дегидрогеназы переносят водород непосредственно на молекулярный кислород, другие - на какие-либо акцепторы, например на хиноны, метиленовую синь.
Для определения активности дегидрогеназы в качестве акцептора водорода применяют бесцветные соли тетразолия (2,3,5-трифенилтетразолий хлористый (ТТХ), которые восстанавливаются в красные соединения формазана (трифенилформазан (ТФФ).
Гидролазы осуществляют реакции гидролиза разнообразных сложных органических соединений, действуя на различные связи: сложноэфирные, глюкозидные амидные, пептидные и др. К этому классу относятся ферменты инвертаза, уреаза и др., активность которых является важным показателем биологической активности почв и широко используется для оценки антропогенного воздействия.
Инвертаза действует на p-фруктофуранозидную связь в сахарозе, рафинозе, стахиоэе и производит расщепление сахарозы на эквимолярные количества глюкозы и фруктозы.
Фотоколориметрическое определение активности инвертазы основано на учете восстанавливающих сахаров, образующихся при расщеплении сахарозы.
Разложение органических азотистых соединений осуществляется при непосредственном участии внеклеточных ферментов. Образующийся при уреазной активности аммиак служит источником питания растений.
Уреаза катализирует гидролиз мочевины. Конечными продуктами гидролиза являются аммиак и углекислый газ. Мочевина попадает в почву в составе растительных остатков, навоза и как азотное удобрение; она образуется также в самой почве в качестве промежуточного продукта в процессе превращения азотистых органических соединений - белков и нуклеиновых кислот.
Определение каталазной активности
Оборудование и реактивы:
Cистема для газометрии (рис. 8); 10%-й раствор Н 2 O 2 ; СаСО э.
Рис. 8 ‑ Установка для газометрического определения каталазной активности в почвенных образцах:
1 - колба, 2 - бюретка, 3 - переходник, 4 - груша с водой
Порядок выполнения работы
1. Навеску просеянной почвы 1 г внести в колбу на 100 см 3 , добавить 0,5 г СаСО 3 .
2. На дно осторожно поставить с помощью пинцета маленький стаканчик с 1,7 см 3 10%-го раствора перекиси водорода.
3. Навеску почвы смочить 4 см 3 дистиллированной воды.
4. Колбу плотно закрыть каучуковой пробкой с трубкой, соединенной с бюреткой толстостенным каучуком через тройник, снабженный зажимом. Бюретка сообщается с грушей. Бюретка и груша заполнены водой. Уровень воды в них уравновешивают и грушу закрепляют на определенной высоте.
5. Начало опыта отметить по секундомеру в момент, когда сосудик с перекисью водорода опрокинут, и вслед за этим встряхнуть содержимое колбы. Взбалтывание смеси следует продолжать во все время опыта, не касаясь непосредственно дна колбы руками. Выделяющийся кислород вытесняет из бюретки воду, уровень которой отмечают.
6. Количество выделившегося молекулярного кислорода учитывают в течение 1 мин при температуре 18-20 0 С.
7. Активность каталазы выражают в объеме (см 3) кислорода, выделившегося на 1 г почвы в минуту. Ошибка определения до 5%.
8. Аналогичные процедуры проделать со всеми образцами почв.
9. По табл. 15 оценить степень насыщения исследуемых почв каталазой.
Таблица15 ‑ Шкала для оценки степени обогащенности почв ферментами
| Степень обогашенности почв | Каталаза, О 2 см 3 /г за 1 мин | Дегидрогеназы, мг ТФФ на 10 г за 24 ч | Инвертаза, мг глюкозы на 1 г за 24 ч | Уреаза, мг NH 4 , на 10 г за 24 ч | Фосфотаза, мг Р 2 О 3 на 10 г за 1 ч |
| Очень бедная | < 1 | <1 | <5 | <3 | <0,5 |
| Бедная | 1-3 | 1-3 | 5-15 | 3-10 | 0,5-1,5 |
| Средняя | 3-10 | 3-10 | 15-50 | 10-30 | 1,5-5,0 |
| Богатая | 10-30 | 10-30 | 50-150 | 30-100 | 5-15 |
| Очень богатая | >30 | >30 | > 150 | > 100 | > 15 |
Определение дегидрогиназной активности
Приборы, посуда, реактивы :
Фотоколориметр; миллиметровая бумага; 0,1М раствор глюкозы; 1 %-й раствор 2,3,5-трифенилтетразолия хлористого (ТТХ); СаСО 3 ; этиловый спирт; трифенилформазан (ТФФ).
Порядок выполнения работы
1. Навески воздушно-сухой почвы по 1 г из каждого образца поместить в пробирки, добавить по 10 мг (на кончике шпателя) СаСО 3 , по 1 см 3 0,1 М раствора глюкозы и по 1 см 3 1%-го раствора ТТХ; содержимое каждой пробирки тщательно смешать.
2. Пробирки поместить в анаэростат и откачать воздух насосом при разрежении 10-12 мм рт. ст. в течение 2-3 мин. Затем инкубировать при 30 0 С в течение 24 ч.
3. По истечении времени инкубации содержимое пробирок экстрагировать в 3-4 приема 25 см 3 этилового спирта. Для этого небольшой объем спирта внести в пробирку и встряхивать в течение 5 мин до появления красной окраски. Дать отстояться и надпочвенную жидкость профильтровать через бумажный фильтр. Добавить в пробирку следующую порцию спирта.
4. Полученный окрашенный раствор формазана колориметрировать на ФЭКе с синим светофильтром (500-600 нм).
5. Количество формазана в миллиграммах рассчитать по стандартной кривой. Для этого приготовить стандартный раствор формазана в этиловом спирте в концентрации 0,1 мг в 1 см 3 . Рабочие растворы для составления кривой приготовить путем разведений стандартного раствора (примерно 5 точек). Стандартную кривую построить на миллиметровой бумаге в системе: оптическая плотность при длине волны 500-600 нм - концентрация формазана в спирте.
6. Вычислить активность дегидрогеназы. По табл. 15 оценить степень насыщения исследуемых почв дегидрогеназой.
Обработка данных
Активность дегидрогеназы (X) выражают в миллиграммах ТФФ на 10 г почвы за сутки по формуле:
где V ‑ общий объем фильтрата, 25 см 3 ;
10 ‑ пересчетный коэффициент веса почвы, г;
v ‑ произведение объемов субстрата и реагента, 1 см 3 ;
А ‑ количество ТФФ, полученное по калибровочной кривой, мг/см 3 . Ошибка определения ‑ до 8 %.
Определение инвертазной активности
Приборы, посуда, реактивы :
Фотоколориметр; 5%-й раствор сахарозы; ацетатный буфер (рН 4,7); толуол; раствор Феллинга: а ‑ 40 г CuSO 4 ×5Н 2 О растворяют в воде и доводят до 1 дм 3 , фильтруют через бумажный фильтр, б ‑ 200 г сегнетовой соли (С 4 H 4 O 6 KNa×4Н 2 О) растворяют в дистиллированной воде, прибавляют 150 г КОН и доводят до 1 дм 3
Порядок выполнения работы
1. В колбы вместимостью 50 см 3 поместить по 5 г каждого образца почвы, добавить по 10 см 3 5%-го раствора сахарозы, 10 мл ацетатного буфера (рН 4,7) и 5-6 капель толуола.
2. Колбы закрыть пробками, встряхнуть, поместить в термостат при температуре 30 0 С на 24 ч и периодически встряхивать их.
3. После инкубации содержимое колб отфильтровать в мерные колбы на 25 см 3 . Довести до метки.
4. Из фильтратов взять по 6 см 3 в большие пробирки, добавить по 3 см 3 раствора сегнетовой соли и 3 см 3 раствора сернокислой меди, хорошо перемешать и кипятить на водяной бане 10 мин. Получается красный осадок.
5. Пробирки с раствором охладить в воде, содержимое отфильтровать в большие пробирки. Прозрачный фильтрат колориметрировать на ФЭК, используя светофильтр с длиной волны 630 нм, ширина кюветы 1 см.
6. Для получения калибровочной кривой приготовить стандартный раствор: 6 мг глюкозы в 1 см 3 . Разведением приготовить серию растворов. Фотоколориметрировать и построить кривую: оптическая плотность ‑ концентрация глюкозы в 1 см 3 .
7. Вычислить активность и по табл. 15 оценить степень насыщения исследуемых почв инвертазой.
Обработка данных
Активность инвертазы (X) выражают в миллиграммах глюкозы на 1 г почвы за 24 ч по формуле:
где А ‑ количество глюкозы, полученное по калибровочной кривой из оптической плотности, мг/см 3 ;
m ‑ навеска почвы, 5 г;
V ‑ общий объем фильтрата, 25 см 3 ;
v ‑ объем фильтрата, взятого для анализа, 6 см 3 .
Ошибка определения ‑ до 5 %.
Определение уреазной активности почв
Приборы, посуда, реактивы :
Фотоколориметр; 2%-й раствор мочевины в фосфатном буфере (рН = 6,7); 50%-й раствор сегнетовой соли; 50%-й раствор CCl 3 COOH (трихлоруксусная кислота); 1%-й раствор КС1; реактив Несслера; стандартный раствор NH 4 C1.
Порядок выполнения работы
1. По 5 г воздушно-сухой почвы поместить в колбы емкостью 100 см 3 , прилить по 20 см 3 2%-го раствора мочевины в фосфатном буфере (рН 6,7) и по 200 мкл толуола.
2. Колбы плотно закрыть и поместить в термостат при температуре 37 0 С на 4 ч.
3. После экспозиции прилить по 1 см 3 50%-го раствора трихлоруксусной кислоты.
4. Для вытеснения из почвы поглощенного аммиака добавить по 50 см 3 1 н. раствора хлористого калия.
5. Содержимое колб отфильтровать.
6. По 2 см 3 фильтрата поместить в мерные колбы объемом 50 см 3 , развести водой до 30 см 3 , затем прилить по 2 см 3 50%-го раствора сегнетовой соли и по 2 см 3 реактива Несслера. Колбы долить водой до метки, перемешать и окрашенный раствор колориметрировать при длине волны 400 нм.
8. Вычисляют активность уреазы.
9. По табл. 15 оценить степень насыщения исследуемых почв уреазой.
Обработка данных
Активность уреазы (X) выражают в миллиграммах N-NH 4 на 1 г почвы за 4 ч по формуле:
V ‑ общий объем фильтрата, 50 см 3 ;
m - навеска почвы, 5 г.
Вопросы для самоподготовки:
1. Что такое каталазная активность?
2. Дайте оределение инвертазной активности.
3. Охарактеризуйте уреазную активность.
4. Что такое буферная смесь?
5. Принцип и сущность метода определения активности почвенных ферментов.
6. Методика отбора образцов почвы.
ПРИЛОЖЕНИЯ
Таблица 1 ‑ Примерный список организмов - индикаторов сапробности
| Организмы | Сапробность |
| Нитчатые бактерии: | |
| Sphaerotilus natans | р |
| Beggiatoa sp. | р |
| Thiothrix sp. | р |
| Грибы: | |
| Leptomitus lacteus | α |
| Mucor racemosus | α |
| Fusarium aquaeductum | р |
| Водоросли: | |
| сине-зеленые: | |
| Anabaena flos aquae | β |
| Microcystis aeruginosa | β |
| Aphanizomenon flos aquae | β |
| Oscillatorla tenuis | α |
| Диатомовые | - |
| Cymbella cesati | о |
| Oomphonema cevli | о |
| Melostra granulata | β |
| Navicula angustata | α |
| Navicula apiculata | α |
| Synedra acus | β |
| Synedra ulna | β |
| Nitzschia palea | α |
| эвгленовые: | |
| Euglena acus | β |
| Euglena viridis | р |
| Euglena deses | α |
| зеленые и протококковые: | |
| Volvox globator | о-β |
| Ankistrodesmus falcatus | β-α |
| Crucigenta rectangularis | а-β |
| Scenedesmus quadricauda | β |
| Draparnaldia sp. | о |
| Ulothrix zonata | о |
| Stlgeoclonium tenue | α |
| Животные: | |
| амебы: | |
| Pelornyxa palustris | р |
| Организмы | Сапробность |
| инфузории: | |
| Colpidium, campylum | p |
| Colpldlum colpoda | p |
| Euplotes charon | β |
| Chllodon cucullulus | p |
| Opercularia coaretata | α |
| Paramecium caudatum | α |
| Spirostomum amblguum | α |
| Stentor coeruleus | α |
| Vortlcella convallarla | α |
| Vorticella microstoma | p |
| Podophrya fixa | α |
| коловратки: | |
| Kellcottia longispina (syn. Notholca Iongispina) | о |
| Keratella cochlearls | β |
| Keratella quadrata | β |
| Leucane lunarls (syn. Monostyla lunarls) | β |
| Rotaria rotatoria (syn. Rotifer vulgaris) | α |
| олигохеты: | |
| Limnodrilus hofmelsterl | p |
| Tub if ex tublfex | p |
| Stylarla lacustris | β |
| ракообразные: | |
| Daplmla magna | α |
| Daphnla pulex | α |
| Leptodora Kindtli | о |
| Eudiaptomus gracilis | o |
| Astacus fluviatilis | o |
| насекомые: | |
| Caenls macrura | o |
| Heptagenia coerulana | β |
| Chironomus Plumosus | р |
| рыбы: | |
| лещ: | β |
| усач | β |
| форель | o |
| линь | β-α |
Таблица 2 ‑ Шкала частот для пересчета организмов в 100 полях на частоту
| Значение частоты | Микробентос | Обрастания | |
| Данные подсчета | Сумма в 100 полях | ||
| 1-я категория крупности | |||
| Не более 1 в каждом 2-м поле зрения Не более 2 в поле зрения Не более 10 в поле зрения Не более 30 в поле зрения Не более 60 в поле зрения Более 60 в поле зрения | Не более 1 в каждом 2-м поле зрения Не более 2 в поле зрения Не более 10 в поле зрения Не более 50 в поле зрения Не более 250 в поле зрения Более 250 в поле зрения | 1-50 50-200 200-1000 1000-5000 5000-25000 Более 25000 | |
| 2-я категория крупности | |||
| Не более 1 в каждом 20-м поле зрения Не более 1 в каждом 5-м поле зрения Не более 1 в поле зрения Не более 3 в поле зрения Не более 6 в поле зрения Более 6 в поле зрения | Не более 2 в 20 полях зрения Не более 1 в 5 поле зрения Не более 1 в поле зрения Не более 5 в поле зрения Не более 25 в поле зрения Более 25 в поле зрения | 1-5 6-20 21-100 100-500 500-2500 Более 2500 | |
| 3-я категория крупности | |||
| 1 в 100 полях зрения 1 в 50 полях зрения Не более 1 в 10 полях зрения Не более 1 в 4 полях зрения Не более 1 в 2 полях зрения Приблизительно 1 в поле зрения | 1 в 100 полях зрения 1 в 50 полях зрения Не более 1 в 10 в полях зрения 1в2 полях зрения Не более 2 в поле зрения Более 2 в поле зрения | 3-10 10-50 50-200 Более 200 |
Приложение
Таблица 13. Пересчет результатов количественного учета на значение частоты
Приложение
Пример вычисления сапробности
Проба: река ниже города. Дата ________________ Сообщество: обрастания.
| Организмы | s | h | sft |
| Euglena viridis | p | ||
| Scenedesmus acuminatus | β | ||
| Spirogyra sygmoidea | β | ||
| Closterium acerosum | α | ||
| Closterium moniliierum | β | ||
| Cyclotella menengiana | α | ||
| Cymbella vesiculosa | β | ||
| Diatoma vulgare | β | ||
| Melosira italica | β | ||
| Melosira varians | β | ||
| Navicula cryptocephala | α | ||
| Navicula viridua | α | ||
| Nitzschia acicularis | β | ||
| Nitzschia palea | α | ||
| Surirella ovata | β | ||
| Chilidonella cuculata | α | ||
| Colpoda cuculus | α | ||
| Sh=41 | S(sh)=103 |
Sh p =3; Sh α =15; Sh β =23.
S=S(sh)/(Sh)-103/41=2,51/
Вычисление погрешности:
Интервал точности для статистической надежности 95%.
S=s±t 0,05 s S =2,51±2,02×0,1;
Похожая информация.
Ферментативная активность почв - один из показателей потенциальной биологической активности почв, характеризующий потенциальную способность системы сохранять гомеостаз.
В почве накапливается определенный «пул» ферментов, качественный и количественный состав которого характерен для данного типа почв.
Характер воздействия нефтяных углеводородов на почвенные ферменты обусловлен прежде всего химической структурой углеводородов. Наиболее сильны-
356 Часть И. Примеры применения биотехнологии ВАВ в науке и производстве
ми ингибиторами являются ароматические соединения, отрицательное влияние которых проявляется ко всем рассмотренным окислительно-восстановительным и гидролитическим ферментам. н-Парафи- новые и цикло-парафиновые фракции, наоборот, оказывают в основном активирующее действие, осо бенно в низких концентрациях. Другой фактор, определяющий характер влияния нефтяного загрязнения, - свойства самой почвы и, прежде всего, ее естественная буферность. Почвы с высокой буферной емкостью менее резко реагируют на загрязнение.
Загрязнение нефтью влияет на ферментативную активность по всему профилю почвы. При загрязнении почв нефтью нарушается обмен основных органогенных элементов в почве: углерода, азота, фосфора. Об этом, в первую очередь, свидетельствуют изменения активности ферментных комплексов, участвующих в их круговороте.
Активность некоторых ферментов: каталазы, уреазы, нитрит- и нитратредуктазы, амилазы можно использовать в качестве индикаторных показателей загрязненности почв нефтью, так как степень изменения активности этих ферментов прямо пропорционально зависит от дозы загрязнителя и от времени пребывания его в почве. Кроме того, определение активности исследованных ферментов не представляет методических трудностей и может быть широко использовано для характеристики почв, загрязненных нефтяными углеводородами.
Окислительно-восстановительные ферменты. Известно, что с окислительно-восстановительными процессами, происходящими при участии различных ферментов, связан распад нефтяных углеводородов в почве. Важнейшими и широко распространенными у почвенных микроорганизмов деструкторами нефти являются ферменты дегидрогеназы и каталазы. Уровень их активности в почве является определенным критерием состояния почвы в отношении самоочищающей способности ее от нефтяных ингредиентов: дегидрогеназа принимает непосредственное участие в разложении углеводородов, а высокоактивный кислород, образующийся при участии каталазы, обеспечивает доступным кислородом микроорганизмы, участвующие в процессах разложения углеводородов.
В результате опытов, проведенных Н.А. Киреевой, установлено, что через 3 дня после загрязнения нефтью активность окислительно-восстановительных ферментов в почве заметно снижается по сравнению с контрольной почвой. Эти изменения сохраняются и через год после загрязнения. Тем не менее, через год после начала опытов активность окислительно-восстановительных ферментов несколько возрастает, заметно снижаются различия между активностью каталазы и дегидрогеназы почвы контрольного и слабозагрязненного варианта, что свидетельствует о способности почвенной экосистемы восстанавливать биологическую активность до исходного уровня в течение года при слабом загрязнении.
Ферменты азотного обмена. В почве обнаруживаются гидролитические и окислительно-восстановительные ферментные системы, осуществляющие последовательное превращение азотсодержащих органических веществ через промежуточные стадии до минеральной нитратной формы, и наоборот, восстанавливающие нитратный азот до аммиака.
Уреаза - фермент, с действием которого связаны процессы гидролиза и превращения в доступную форму азота мочевины, - наиболее изучен. В нефтезагрязненных почвах активность уреазы возрастает как в полевых, так и в лабораторных опытах во всех рассматриваемых почвах. Изменение активности этого фермента находится в полном соответствии с ростом численности гетеротрофных микроорганизмов, повышением содержания аммиачных форм азота и общего азота в загрязненной почве. Активность других гидролитических ферментов азотного обмена - протеазы, аспарагиназы, глутаминазы - снижается под воздействием нефтяного загрязнения.
Большая роль в азотном обмене в почве принадлежит окислительно-восстановительным ферментам: нитратредуктазе, нитритредуктазе и гидроксиламинредуктазе, которые в анаэробных условиях участвуют в процессах восстановления окисленных форм азота до аммиака. Загрязнение почвы нефтью неоднозначно действует на эти ферменты. Активность нитратредуктазы и нитритредуктазы снижается, а активность гидроксиламинредуктазы повышается.
Активность уреазы, нитрит- и нитратредуктазы можно использовать в качестве одного из диагностических показателей загрязнения почв нефтью, так как, во-первых, эти ферменты меньше подвержены действию экологических факторов, во-вторых, прослеживается четкая зависимость активности их от степени загрязнения почв.
Активность гидролитических ферментов, участвующих в круговороте углерода. Основная роль в круговороте углерода в почвах принадлежит карбогидразам, расщепляющим углеводы различной природы и происхождения.
Сразу после загрязнения темно-серой лесной почвы не обнаружено достоверных различий между активностью инвертазы почв загрязненных и не загрязненных вариантов. Повышение активности через год в образцах со слабой и средней дозами загрязнения, вероятно, связано с интенсивным разложением отмерших растительных остатков. Высокая концентрация нефти, ведущая к созданию анаэроби- озиса в большей степени, чем слабая и средняя, создает лимитирующие условия для развития
аэробных целлюлозоразрушающих микроорганизмов при обилии субстрата. Этим можно объяснить наблюдаемое снижение активности инвертазы в данном варианте. Активность целлюлазы и амилазы снижается при воздействии нефти.
Таким образом, рассмотрение функционирования только трех основных ферментов углеводного обмена при попадании нефтяных углеводородов в почву свидетельствует о глубоких изменениях, происходящих в почве. Замедляются процессы распада растительных остатков, следствием чего является изменение трансформации органических соединений в сторону ухудшения. Прослеживается четкая зависимость активности карбогидраз от степени загрязнения почвы нефтью.
Фосфогидролазы. В почве фосфор представлен в виде неорганических и органических соединений. Недоступные формы фосфора усваиваются растениями благодаря деятельности фосфогидролаз, отщепляющих фосфор от органических соединений. Загрязнение серой лесной почвы нефтью снижает активность фосфатазы. Причиной такого снижения активности фосфатазы может быть как обволакивание почвенных частиц нефтью, препятствующее поступлению субстрата, так и ингибирующее действие тяжелых металлов, концентрация которых в нефтезагрязненных почвах увеличивается. Наблюдаемое снижение активности фосфатаз является одной из причин уменьшения содержания подвижного фосфора нефтезагрязненной почвы. Через год после загрязнения активность фосфатазы сохраняется на низком уровне, содержание подвижного фосфора с ростом дозы нефти уменьшается.
Нефтяные углеводороды ингибируют активность ДНКазы, РНКазы, АТФазы.
Таким образом, попадание нефти в почву приводит к нарушению фосфорного режима почвы, уменьшению содержания подвижных фосфатов, к инактивации фосфогидролаз. В результате ухудшается фосфорное питание растений, обеспеченность их доступными формами фосфора.
По типу катализируемых реакций все известные ферменты разделены на шесть классов:
1. Оксидоредуктазы, катализирующие окислительно-восстановительные реакции.
2. Гидролазы, катализирующие реакции гидролитического расщепления внутримолекулярных связей в различных соединениях.
3. Трансферазы, катализирующие реакции межмолекулярного или внутримолекулярного переноса химической группы и остатков с одновременным переносом энергии, заключенной в химических связях.
4. Лигазы (синтетазы), катализирующие реакции соединения двуx молекул, сопряжённые с расщеплением фирофосфатных связей АТФ или другого аналогичного трифосфата.
5. Лиазы, катализирующие реакции негидролитического отщепления или присоединения различных химических групп органических соединений по двойным связям.
6, Изомеразы, катализирующие реакции превращения органических соединений в их изомеры.
В почве широко распространены и довольно подробно изучены оксидоредуктазы и гидролазы, имеющие очень важное значение в почвенной биодинамике.
Каталаза
(Н 2 О 2: Н 2 О 2 –оксидоредуктаза)
Каталаза катализирует реакцию разложения перекиси водорода с образованием воды и молекулярного кислорода:
Н 2 О 2 + Н 2 О 2 О 2 + Н 2 О.
Перекись водорода образуется в процессе дыхания живых организмов и в результате различных биохимических реакций окисления органических веществ. Токсичность перекиси водорода определяется его высокой реакционной способностью, которую проявляет синглетный кислород, *О 2 . Его высокая реакционная способность приводит к неконтролируемым реакциям окисления. Роль каталазы заключается в том, что она разрушает ядовитую для организмов перекись водорода.
Каталаза широко распространена в клетках живых организмов, в том числе микроорганизмов и растений. Высокую каталазную активность проявляют также почвы.
Методы определения каталазной активности почвы основаны на измерении скорости распада перекиси водорода при взаимодействии ее с почвой по объему выделяющегося кислорода (газометрические методы) или по количеству неразложенной перекиси, которое определяют перманганатометрическим титрованием или колориметрическим методом с образованием окрашенных комплексов.
Исследованиями Е.В. Даденко и К.Ш. Казеева установлено, что при хранении образцов активность каталазы из всех ферментов снижается в наибольшей степени, поэтому ее определение необходимо проводить в первую неделю после отбора образцов.
Метод А.Ш. Галстяна
Ход анализа. Для определения активности каталазы используют прибор из двух соединенных резиновым шлангом бюреток, которые заполняют водой и уравновешивают ее уровень. Поддерживание определенного уровня воды в бюретках свидетельствует о достижении температурного равновесия в приборе. Навеску (1 г) почвы вносят в одно из отделений сдвоенной колбы. В другое отделение колбы приливают 5 мл 3-процентного раствора перекиси водорода. Колбу плотно закрывают каучуковой пробкой со стеклянной трубкой, которая соединена с измерительной бюреткой с помощью резинового шланга.
Опыт проводят при температуре 20 °С, так как при другой температуре скорость реакции будет отличаться, что исказит результаты. В принципе важна температура не воздуха, а перекиси, именно она должна быть 20 0 С. Если температура воздуха значительно выше 20 0 С (летом), рекомендуется проводить анализ в подвале или в другом прохладном помещении. Рекомендованное в таких случаях применение водяной бани с температурой 20°С вряд ли эффективно.
Начало опыта отмечают по секундомеру или песочным часам в тот момент, когда перекись смешивается с почвой, и содержимое сосуда встряхивают. Взбалтывание смеси производят в течение всего опыта, стараясь не касаться колбы руками, держа ее за пробку. Выделяющийся кислород вытесняет из бюретки воду, уровень которой отмечают через 1 и 2 мин. Рекомендация определять количество кислорода через каждую минуту в течение 3 мин ввиду прямолинейности реакции разложения перекиси лишь увеличивает затраты времени на анализ.
Данная методика позволяет одному исследователю за день проанализировать активность каталазы более чем 100 образцов. Удобно проводить анализ вдвоем, используя 5-6 сосудов. При этом один человек непосредственно занимается анализом и следит за уровнем бюретки, а второй следит за временем, записывает данные и моет сосуды.
Контролем служит стерилизованная сухим жаром (180°С) почва. Некоторые почвы, соединения и минералы обладают высокой активностью неорганического катализа разложения перекиси даже после стерилизации - до 30-50 % от общей активности.
Активность каталазы выражают в миллилитрах О 2 , выделяющегося за 1 мин из 1 г почвы.
Реактивы: 3-процентный раствор Н 2 О 2 . Концентрацию пергидроля обязательно периодически проверяют, рабочий раствор готовят непосредственно перед анализом. Для установления концентрации пергидроля на аналитических весах в мерной колбе емкостью 100 мл взвешивают 1 г Н 2 О 2 , объем доводят до метки и взбалтывают. Помещают 20 мл полученного раствора в конические колбы на 250 мл (3 повторности), добавляют 50 мл дистиллированной воды и 2 мл 20-процентной Н 2 SO 4 . Затем титруют 0,1 н. раствором КМnО 4 . 1 мл раствора КМnО 4 соответствует 0,0017008 г Н 2 О 2 . После установления концентрации пергидроля готовят 3-процентный раствор разбавлением дистиллированной водой. Титровальный раствор КМnО 4 готовят из фиксанала и выдерживают несколько дней для установления титра.
Дегидрогеназы
(субстрат: НАД (Ф)-оксидоредуктазы).
Дегидрогеназы катализируют окислительно-восстановительные реакции путем дегидрирования органических веществ. Они проходят по следующей схеме:
АН 2 + В А+ ВН 2
В почве субстратом дегидрирования могут быть неспецифические органические соединения (углеводы, аминокислоты, спирты, жиры, фенолы и т.д.) и специфические (гумусовые вещества). Дегидрогеназы в окислительно-восстановительных реакциях функционируют как переносчики водорода и разделяются на две группы: 1) аэробные, передающие мобилизированный водород кислороду воздуха; 2) анаэробные, которые передают водород другим акцепторам, ферментам.
Основным методом обнаружения действия дегидрогеназ является восстановление индикаторов с низким редокс-потенциалом типа метиленовой сини.
Для определения активности дегидрогеназ почвы в качестве водорода применяют бесцветные соли тетразолия (2,3,5-трифенилтетразолий хлористый - ТТХ), которые восстанавливаются в красные соединения формазанов (трифенилформазан - ТФФ).
Ход анализа. Навеску (1 г) подготовленной почвы аккуратно через воронку помещают на дно пробирки емкостью 12-20 мл и тщательно перемешивают. Прибавляют 1 мл 0,1 М раствора субстрата дегидрирования (глюкоза) и 1 мл свежеприготовленного 1-процентного раствора ТТХ. Пробирки помещают в анаэростат или вакуумный эксикатор. Определение проводят в анаэробных условиях, для чего воздух эвакуируют при разрежении 10-12 мм рт. ст. в течение 2-3 мин и ставят в термостат на 24 ч при 30 °С. При инкубировании почвы с субстратами толуол в качестве антисептика не прибавляют, так как; он сильно ингибирует действие дегидрогеназ. Контролем служат стерилизованная почва (при 180°С в течение 3 ч) и субстраты без почвы. После инкубации в колбы добавляют 10 мл этилового спирта или ацетона, встряхивают 5 мин. Полученный окрашенный раствор ТФФ фильтруют и колориметрируют. При очень интенсивной окраске раствор разбавляют спиртом (ацетоном) в 2-3 раза. Используют 10-мм кюветы и светофильтр с длиной волны 500-600 им. Количество формазана в мг рассчитывают по стандартной кривой (0,1 мг в 1 мл). Активность дегидрогеназ выражают в мг ТТФ на 10 г почвы за 24 ч. Ошибка определения до 8 %.
Реактивы:
1) 1-процентный раствор 2,3,5-трифенилтетразолия хлористого;
2) 0,1 М раствор глюкозы (18 г глюкозы растворяют в 1000 мл дистиллированной воды);
3) этиловый спирт или ацетон;
4) трифенилформазан для стандартной шкалы. Для составления калибровочной кривой готовят ряд растворов в этиловом спирте, ацетоне или толуоле с концентрацией формазана (от 0,01 до 0,1 мг формазана в 1 мл) и фотоколориметрируют, как описано выше.
При отсутствии формазана его получают восстановлением ТТХ гидросульфитом натрия (сульфитом аммония, порошком цинка в присутствии глюкозы). Исходная концентрация раствора ТТХ 1 мг/мл. К 2 мл исходного раствора ТТХ добавляют на кончике ланцета кристаллический гидросульфит натрия. Выпавший осадок формазана извлекают 10 мл толуола. В таком объеме толуола содержится 2 мг формазана (0,2 мг/мл). Дальнейшим разведением готовят рабочие растворы для шкалы.
Инвертаза
(β-фруктофуранозидаза, сахараза)
Инвертаза является карбогидразой, она действует на β-фруктофуранозидазную связь в сахарозе, раффинозе, генцианозе и др. Наиболее активно этот фермент гидролизует сахарозу с образованием редуцирующих сахаров - глюкозы и фруктозы:
инвертаза
С 12 Н 22 О 11 + Н 2 О С 6 Н 12 О 6 + С 6 Н 12 О 6
сахароза глюкоза фруктоза
Инвертаза широко распространена в природе и встречается почти во всех типах почв. Очень высокая активность инвертазы обнаружена в горно-луговых почвах. Активность инвертазы четко коррелирует с содержанием гумуса и почвенным плодородием. Рекомендуется при изучении влияния удобрений для оценки их эффективности. Методы определения активности инвертазы почв основаны на количественном учете восстанавливающих сахаров по Бертрану и по изменению оптических свойств раствора сахарозы до и после воздействия фермента. Первый способ может быть применен при изучении фермента с очень широкой амплитудой активности и концентрации субстрата. Поляриметрический и фотоколориметрический способы более требовательны к концентрации сахаров и неприемлемы для почв с высоким содержанием органического вещества, где получаются, окрашенные растворы; поэтому эти методы ограниченно применяются в почвенных исследованиях.
